De konstante innbruddene fra den spanske erobreren Don Nuño Beltrán de Guzmán mot de vestlige landene i landet, for å øke hans herredømme og makt over disse områdene, resulterte i etableringen av en ny provins kalt Kongeriket Ny Galicia.
Regionen var bebodd av forskjellige urfolksgrupper, som kontinuerlig herjet bosetningene som spanjolene hadde grunnlagt i den. Nuño de Guzmáns løytnant, kaptein Juan B. de Oñate, fikk ordre om å berolige provinsene og å stifte Villa de Guadalajara på stedet som heter Nochistlán, et faktum at han fullbyrdet 5. januar 1532. I lys av hyppige urfolkangrep på byen han måtte flytte et år senere til Tonalá og senere til Tlacotlán. En tredje overføring ble foretatt for å bosette byen i Atemajac-dalen, der byen ble endelig grunnlagt 14. februar 1542 med nærvær av Cristóbal de Oñate som guvernør i Nueva Galicia og Don Antonio de Mendoza, den gang vicekonge i New Spain, som utnevnte Miguel de Ibarra til borgermester og løytnantguvernør.
Byen utviklet seg raskt og begynte å konkurrere med Compostela (i dag Tepic), som da var sete for religiøse og sivile makter, slik at innbyggerne i Guadalajara utøvde et slikt press på Audiencia-myndighetene, at kongen Felipe II bestemte seg for å utstede et sertifikat datert 10. mai 1560 for å flytte fra Compostela til Guadalajara, katedralen, Royal Court og Treasury-tjenestemenn.
Den urbane strukturen ble planlagt i henhold til de andre kolonibyene, så utformingen ble utviklet i form av et sjakkbrett fra det som var San Fernando-torget. Senere ble nabolagene Mexicaltzingo og Analco etablert av Fray Antonio de Segovia, og nabolaget Mezquitán, en av de eldste. Rådhushusene ble også reist, overfor det nåværende San Agustín-tempelet og den første menighetskirken der Justisens palass ligger.
I dag viser den storslåtte byen, frodig i koloniale bygninger, et stort antall relevante arkitektoniske eksempler, som katedralen, et must-see sted, bygget mellom 1561 og 1618 av arkitekten Martín Casillas. Hans stil er klassifisert som begynnende barokk. Den solide strukturen stiger foran dagens Plaza de Guadalajara, med sine nysgjerrige tårn som, selv om de ikke tilhører den opprinnelige stilen til bygningen, for tiden er anerkjent som et symbol på hovedstaden i Guadalajara. De primitive tårnene ble ødelagt i det nittende århundre av et jordskjelv, så de de har i dag ble lagt til. Det indre av tempelet er halvgotisk i stil, inkludert dets hvelv som er laget av blonder.
Andre religiøse distrikter fra 1500-tallet er San Francisco-klosteret, etablert i 1542 nær elven, i Analco-området, og nesten fullstendig ødelagt i reformasjonen. Templet, som ble renovert på slutten av 1600-tallet, med sin barokke fasade med beskjedne soloniske linjer, er bevart. Klosteret San Agustín, ble grunnlagt i 1573 av Royal Ordinance of Felipe II og bevarer for tiden tempelet med fasaden av strenge herreriske linjer og interiøret med ribbet hvelv.
Santa María de Gracia, en annen av de grunnleggende grunnlagene, ble okkupert av dominikanske nonner fra Puebla, bygget i 1590 foran Plaza de San Agustín og betalt av Hernán Gómez de la Peña. Byggingen kom til å okkupere seks blokker, selv om bare tempelet i dag vedvarer, med en nyklassisistisk fasade fra andre halvdel av 1700-tallet.
